フローサイトメトリーの読み方

造血器悪性腫瘍を診断するためのフローサイトメトリーの見方についてのブログです。 血液疾患を診療する医師、および末梢血や骨髄の検査を担当する検査技師向けの内容になります。

Case 011

消化管に腫瘤性病変を認めました。 内視鏡所見でリンパ腫が疑われていたため、生検検体をフローサイトメトリーに提出しました。
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7AAD-SSCで展開し、7AAD陽性の死細胞を外しています。7AAD陰性の細胞(生細胞)をFSC, SSCで展開し、gateAとgateBの中身を見ています。大きな細胞(FSCが高い細胞)の領域がgate(A)、小細胞領域がgate(B)となっています。

gate(A)には25.1%の細胞が存在しています。
κ鎖陽性細胞がほとんどで、CD19, CD20も陽性なのでクローナルなB細胞が存在すると判断できます。B細胞性リンパ腫でしばしば陽性になるCD5やCD10は陰性です。

gate(B)はT細胞 93.6%(CD4 65.9%、CD8 29.4%)、B細胞 5.4%、NK細胞 2.0%です。この領域でもκ/λは8.2/0.2とκに偏っており、リンパ腫細胞が少し混入しているようです。

病理診断はDiffuse large B-cell lymphoma (non-GC type)でした。

フローサイトメトリーの所見
大細胞領域にCD19+CD20+κ+(CD5, CD10は陰性)のクローナルな細胞集団を認め、B細胞性リンパ腫と考える。

細胞内染色

これまで「表面マーカー」という言葉を使ってきましたが、フローサイトメトリーでは細胞表面には発現していない、細胞質に存在する抗原についても調べることができます。

代表的な細胞質内の抗原としてミエロペルオキシダーゼ(MPO)を例に挙げます。御存知のように、MPOは顆粒球系の細胞のマーカーになります。しかし、MPOは細胞表面に発現していないため、ある細胞がMPO陽性かどうかは通常のフローサイトメトリーではわかりません。そこで細胞内染色を行うことによって、細胞質に存在する抗原の有無を調べることができます。

たとえば、白血病細胞のMPOをフローサイトメトリーで判断したいとします。上記のように、MPOは表面に発現していないため抗MPO抗体を使っても通常の表面マーカーのようには検査できません。

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そこで、細胞内染色を行います。詳細な手順は省きますが、細胞膜に穴をあけることにより、そこから蛍光色素で標識した抗体が細胞内に入ることができます。細胞内に入った抗体がMPOと反応することになります。

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これをフローサイトメーターで解析します。

細胞内染色で検査した場合はcytoplasmic MPO(cyMPO)と表記することがあります。MPOは細胞内にしか存在しないので、わざわざ「cytoplasmic」をつけずにMPOとだけ表記することもあります。CD3などは表面にも発現しているため、区別が必要なときは細胞表面のCD3をsCD3 (surface CD3)、細胞内のCD3をcyCD3と表記します。
造血器腫瘍の診断のために、MPO、cyCD3の他にTdTやcyλ・cyκなどの細胞内染色が用いられます。

なお、細胞内染色を行って解析すると、非特異な蛍光が強くなります。そのため、陰性・陽性のカットオフについては注意する必要があります。

まとめ
細胞表面に発現していない抗原でも、細胞膜に穴を開け細胞内染色を行うことで解析が可能となる。

Case 010

高齢男性。汎血球減少と末梢血中への芽球の出現を認め骨髄検査を施行。

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CD45dim領域(gate1)に15.6%の細胞を認めます。
ゲート内の細胞はほぼすべてがCD33陽性です。CD13、CD34は一部陽性です。
CD13, CD33, CD34は未成熟な正常骨髄系の細胞でも発現します。そのため、ゲート内の細胞が正常な細胞であるか異常な細胞であるかをフローサイトメトリーだけで区別することは難しいと思います。ただ、通常はCD45dim領域に15%もの細胞がいることはないので、骨髄芽球が増加しているんだろうという判断にはなります。

リンパ球領域(gate2)に23.3%の細胞を認めます。
ゲート内において、T細胞 74.8%(CD4 46.1%、CD8 30.3%)、B細胞 4.6%、NK細胞 74.4+19.0-74.8 = 18.6%。この領域に明らかな異常細胞は指摘できません。

骨髄の鏡検では異形成があり、芽球を15.4%認めました。MDS RAEB-2と診断しています。


ここからは蛇足かもしれませんが、実際にフローサイトメトリーの結果を解釈するときに判断に迷う点について触れます。
gate1の中のCD33陽性細胞はGP-Aが弱陽性のようにも見えます・・・が、あえてGP-Aについて言及する必要はないと思います。この症例のように、GP-Aが弱陽性に見えることはよくあります。じゃあこれが赤芽球系の細胞か、あるいはaberrant expressionかというと・・・そこまでは言い難いと思います。
CD7も弱陽性のように見えます。ただ、CD7については非特異な蛍光にも見えるので・・・微妙ですね。これもことさらにCD7陽性と解釈する必要はないと個人的には思います。ただ、このような例で治療経過中や、再発した時に異常細胞のCD7陽性がはっきりしてくることもあります。なので、CD7については弱陽性かもしれないな・・・と思っておいても良いと思います。

なんとなく歯切れが悪い感じになりましたが、フローサイトメトリーでは特定の抗原について陽性とも陰性とも断言しにくいことはよくあります。臨床診断や、フローサイトメトリーの結果で治療方針が変わるかどうか・・・という点もあわせて総合的に判断していくしかないと思います。


フローサイトメトリーの所見
CD45dim領域にCD33+(CD13, CD34は一部陽性)の細胞を全体の約15%認める。
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